合成染料根據(jù)其結(jié)構(gòu)可分為偶氮類、蒽醌類、雜環(huán)類、酞菁類等，應(yīng)用于紡織印染、造紙、皮革、化妝品、制藥等行業(yè).在印染行業(yè)使用的染料就超過(guò)1000種，全球每年的染料使用量估計(jì)高達(dá)800000 t，其中的10%~15%在染色過(guò)程中隨著廢水排出;許多染料有致突、致癌毒性，而且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，市政污水系統(tǒng)的好氧處理難以對(duì)印染廢水進(jìn)行脫色;吸附、絮凝、離子交換、超濾、電化學(xué)、化學(xué)氧化、光催化氧化等物理化學(xué)方法可以對(duì)印染廢水進(jìn)行脫色，但成本較高.近年來(lái)微生物酶法脫色作為一種環(huán)境友好技術(shù)受到廣泛關(guān)注.
漆酶是一種含有銅離子的多酚氧化酶，它能催化多酚、木質(zhì)素、氨基苯酚、多胺、芳基二胺等多種芳香族、非芳香族化合物發(fā)生氧化反應(yīng).它催化的特點(diǎn)就是使氧分子還原成為水，同時(shí)底物所形成的自由基可以自身結(jié)合或者相互偶聯(lián)，形成聚合物或偶聯(lián)物，而不產(chǎn)生其他物質(zhì)(劉濤等，2005)，因此漆酶的優(yōu)點(diǎn)在于其催化染料脫色時(shí)不產(chǎn)生新的有害產(chǎn)物，是一種環(huán)保用酶.能夠產(chǎn)生漆酶的物種有很多，包括動(dòng)物、植物、細(xì)菌、真菌等，其中利用白腐真菌生產(chǎn)漆酶被認(rèn)為最具前景，Ganoderma lucidum分泌的漆酶具有耐熱性好、最適pH偏酸、脫色效率高等特點(diǎn).
紡織印染廢水中成分復(fù)雜，含有多種染料、紡織助劑、鹽類、表面活性劑、紡織品降解物等，而目前漆酶脫色研究主要集中于對(duì)單種染料的降解.酸性黑ATT(圖 1)屬于一種復(fù)合的偶氮染料，由酸性黑10B和酸性橙Ⅱ按照70 ∶ 30比例調(diào)合而成，常用于毛、絲、棉綸及其混紡織物的染色，是一種代表性的復(fù)合染料.本研究利用Ganoderma lucidum wz-32所產(chǎn)漆酶催化酸性黑ATT脫色的條件，同時(shí)考慮到漆酶的催化作用會(huì)受到金屬離子、酶抑制劑和催化助劑的影響，研究了一些金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)脫色的影響，以期為漆酶在復(fù)合染料廢水脫色處理領(lǐng)域的深入研究及工業(yè)化應(yīng)用提供基礎(chǔ).
圖 1 酸性黑ATT染料組成及分子結(jié)構(gòu)
2 材料與方法
2.1 染料
酸性黑ATT(Acid Black ATT)，購(gòu)自溫州市化工市場(chǎng).
2.2 化學(xué)試劑
ABTS(2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽)、HBT(1-羥基-苯并-三氮唑)，購(gòu)自Sigma公司;磷酸氫二鈉、檸檬酸、硫酸銅、氯化鈷、硫酸鈉、硫酸亞鐵、氯化錳、碘化鉀、EDTA-鈉(乙二胺四乙酸二鈉)、SDS(十二烷基硫酸鈉)等試劑均為市售分析純.
2.3 漆酶的制備
將白腐菌Ganoderma lucidum wz-32(溫州大學(xué)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室保存)接種于150 mL種子培養(yǎng)基(葡萄糖2%，玉米粉2%，豆粕2%，硫酸鎂0.075%，磷酸氫二鉀0.15%，水)在28 ℃、165 r · min-1搖床培養(yǎng)7d.將種子液按10%的接種量接種于發(fā)酵罐中，28 ℃液體發(fā)酵培養(yǎng)5d(培養(yǎng)基:可溶性淀粉2%，花生殼3%，豆粕1.5%，硫酸鎂0.075%，磷酸氫二鉀0.15%，硫酸銅0.01%，水).發(fā)酵結(jié)束后5000 r · min-1離心條件下取上清液即為粗酶液，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?
2.4 酶活性的測(cè)定
反應(yīng)總體系3 mL，含0.1 mL經(jīng)稀釋的酶液，1.9 mL pH 3.0的緩沖液(檸檬酸-磷酸氫二鈉)和1.0 mL 0.5 mmol · L-1 ABTS溶液.50 ℃水浴保溫3 min，420 nm處測(cè)定吸光值.每min氧化1 μmol底物(ABTS，吸光系數(shù)為36000 L ·(mol · cm)-1)所需要的酶量為1個(gè)酶活單位(U).
2.5 染料最大吸收光譜的測(cè)定
用蒸餾水把酸性黑ATT配成0.1 g · L-1的母液，測(cè)定時(shí)將溶液稀釋到線性范圍內(nèi)，以蒸餾水為參比，進(jìn)行光譜掃描得到酸性黑ATT的最大吸收波長(zhǎng)為636.00nm.
2.6 染料的脫色試驗(yàn)和脫色率的計(jì)算
在20mL的反應(yīng)體系中，用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液調(diào)整脫色體系的pH，控制變量法依次改變脫色pH、時(shí)間、溫度、酶活、染料濃度進(jìn)行試驗(yàn).分別測(cè)定脫色前后的吸光值(A)，脫色率的計(jì)算公式(Khlifi et al., 2010):
式中，A0、A分別表示初始時(shí)刻和t時(shí)刻染料在最大吸收波長(zhǎng)下的吸光值.實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值.
2.7 正交優(yōu)化試驗(yàn)
為確定漆酶催化酸性黑ATT脫色的最佳條件，對(duì)加酶量、pH、溫度、染料濃度進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)，選用L9(34)正交表安排試驗(yàn)，各因素的試驗(yàn)水平根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果確定，具體見(jiàn)表 1.
表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平
3 結(jié)果與討論
3.1 時(shí)間對(duì)脫色效果的影響
在pH 5.0、加酶量6 U · mL-1、溫度為60 ℃、染料濃度0.1 g · L-1時(shí)，分別在保溫5、10、20、30、40、50、60、70、80 min時(shí)取樣，測(cè)定脫色率.結(jié)果(圖 2)表明隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，染料溶液的脫色率變化先快后慢，在反應(yīng)的前20 min，其脫色率變化是最快的，20 min后其脫色率變化越來(lái)越小，60 min以后脫色率變化不大.隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，酶與染料中的成分已經(jīng)充分接觸并使之脫色，60 min后體系中的染料濃度較低，不利于與酶活性中心結(jié)合，所以確定脫色時(shí)間為60 min進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn).
圖 2 漆酶催化酸性黑ATT脫色隨時(shí)間的變化
3.2 pH對(duì)脫色效果的影響
在加酶量6 U · mL-1、溫度60 ℃、染料濃度0.1 g · L-1條件下，分別調(diào)節(jié)緩沖液pH為3、4、5、6、7、8，保溫60 min.研究pH對(duì)漆酶催化酸性黑ATT脫色的影響，結(jié)果(圖 3)表明，當(dāng)pH為3~8時(shí)，隨著pH的增大，脫色率呈先上升后下降的趨勢(shì)，pH為5時(shí)脫色效果最好.pH是影響酶活的主要因素之一，對(duì)酶活的影響關(guān)系到酶作用于染液的效果，而漆酶的酶活在偏酸的環(huán)境中較高，在酸性條件下有利于漆酶催化酸性黑ATT脫色.G.lucidum所產(chǎn)漆酶適應(yīng)的pH范圍較寬，在pH 4.0~7.5酶活穩(wěn)定，pH 4.0對(duì)偶氮染料Remazol Black-5和蒽醌染料Remazol Brilliant Blue R的脫色效果最好.
圖 3 pH對(duì)漆酶催化酸性黑ATT脫色的影響
3.3 溫度對(duì)脫色效果的影響
在pH 5.0、加酶量6 U · mL-1、染料濃度0.1 g · L-1條件下，分別設(shè)定溫度為40、50、60、70 ℃，保溫60 min.研究溫度對(duì)漆酶催化酸性黑ATT脫色的影響，結(jié)果(圖 4)表明，在40~60 ℃范圍內(nèi)，脫色率變化不大，脫色率最高可達(dá)81%.G. lucidum所產(chǎn)漆酶為耐熱性酶，在60 ℃時(shí)的半衰期為2 h，4 h后殘存酶活為25%，但70 ℃時(shí)酶活快速下降，本研究結(jié)果與之相一致，當(dāng)溫度為70 ℃時(shí)，脫色率明顯減小，因?yàn)闇囟冗^(guò)高會(huì)導(dǎo)致酶蛋白變性，使酶的活性大幅下降，導(dǎo)致脫色率降低.
圖 4 溫度對(duì)漆酶催化酸性黑ATT脫色的影響
3.4 酶量對(duì)脫色效果的影響
在pH 5.0、溫度60 ℃、染料濃度0.1 g · L-1條件下，分別加入3~30 U · mL-1酶量，保溫60 min，研究加酶量對(duì)漆酶催化酸性黑ATT脫色的影響.結(jié)果如圖 5所示，在小于6 U · mL-1的酶活范圍內(nèi)，隨著加酶量的增加，脫色率與加酶量成正相關(guān)，隨著酶的增多，反應(yīng)活性中心增多，有利于與底物的結(jié)合從而提高脫色的效率，加酶量在6 U · mL-1時(shí)脫色率為84.62%，但繼續(xù)增加酶量并不能進(jìn)一步顯著提高脫色率，這一結(jié)果與Murugesan等的結(jié)果相一致.
圖 5 加酶量對(duì)酸性黑ATT脫色的影響
在pH 5.0、加酶量6 U · mL-1、溫度60 ℃條件下，分別添加濃度為0.05、0.10、0.15 g · L-1、0.20、0.25、0.30 g · L-1的酸性黑ATT染料，保溫60 min，比較一定量的酶液脫色的染料濃度限度.如圖 6所示，在染料濃度為0.05～0.30 g · L-1時(shí)，脫色效果呈下降趨勢(shì)，但脫色率相差不大，都在80%以上，表明G. lucidum wz-32所產(chǎn)漆酶能耐受較高濃度的酸性黑ATT染料.提高染料濃度在前期脫色率較低，但隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，脫色率會(huì)逐漸上升，偶氮染料Remazol Black-5和蒽醌染料Remazol Brilliant Blue R在0.3 g · L-1濃度下對(duì)漆酶沒(méi)有抑制作用.酸性黑ATT中含有磺酸基(—SO3)，磺酸基對(duì)染料的生物降解有一定的抑制作用.
圖 6 染料濃度對(duì)酸性黑ATT脫色的影響
3.6 正交試驗(yàn)優(yōu)化
對(duì)加酶量、pH、溫度、染料濃度4個(gè)因子進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化，結(jié)果(表 2)表明，對(duì)脫色率影響大小依次為C>B>D>A，即溫度>pH值>染料濃度>加酶量，最優(yōu)組合為A3B2C2D1，所對(duì)應(yīng)的最佳條件為：加酶量9 U · mL-1、反應(yīng)pH 5.0、溫度為50 ℃、染料濃度為0.1 g · L-1.在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)得到的脫色率為87.35%.
表2 酸性黑ATT脫色的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果
3.7 金屬離子對(duì)脫色效果的影響
紡織廢水中往往含有Cu2+、Co2+、Zn2+、Na+等金屬離子，為探究各離子對(duì)脫色效果的影響，在正交試驗(yàn)所得的最優(yōu)條件下分別添加氯化鈷、硫酸鈉、硫酸亞鐵、硫酸鎂、氯化錳、硫酸銅、氯化鈣、氯化鉀、碘化鉀，濃度分別為0、0.5、1、5、10 mmol · L-1.結(jié)果表明，對(duì)脫色作用具有促進(jìn)作用的離子有：Na+、Mg2+、Cu2+，但在試驗(yàn)范圍內(nèi)促進(jìn)作用不顯著;具有抑制作用的離子有Co2+、Fe2+、Mn2+、Ca2+、I-(圖 7)，10 mmol · L-1的濃度可使脫色率降低50%以上;其中Mn2+的抑制作用尤為顯著，0.5 mmol · L-1的濃度就使脫色率減小50%以上.通過(guò)KCl和KI的比較試驗(yàn)，可以看出，I-濃度為10 mmol · L-1時(shí)脫色率只有17.01%，具有很強(qiáng)的抑制作用，因?yàn)镮-可以抑制酶活，從而降低脫色率.
圖 7 不同離子對(duì)漆酶催化酸性黑ATT脫色的影響
銅離子在濃度小于1 mmol · L-1時(shí)，對(duì)脫色略有促進(jìn)作用，而隨著銅離子濃度的上升，脫色率明顯下降.Cu2+是漆酶的組成部分，也是其活性中心，適量的Cu2+對(duì)漆酶的活性有促進(jìn)作用.但是高濃度銅離子卻會(huì)起反作用，因?yàn)楦邼舛入x子對(duì)染料本身的色澤起了加深作用.
3.8 酶抑制劑對(duì)脫色效果的影響
EDTA-鈉是一種絡(luò)合劑能夠與金屬陽(yáng)離子形成高度穩(wěn)定的水溶性絡(luò)合物，EDTA-鈉能夠與漆酶的銅離子結(jié)合，從而改變漆酶的活性結(jié)合位點(diǎn);SDS是一種離子型去污劑，可使蛋白質(zhì)變性.在正交試驗(yàn)所得的最優(yōu)條件下，分別加入0、0.1、0.5、1、10 mmol · L-1的EDTA-鈉、SDS，探究酶抑制劑對(duì)脫色率的影響.結(jié)果(圖 8)表明，EDTA-鈉對(duì)脫色的抑制作用不顯著，加入量達(dá)10 mmol · L-1時(shí)才顯現(xiàn)一定的抑制效果.SDS對(duì)脫色的抑制作用很強(qiáng)，濃度為10 mmol · L-1時(shí)脫色率降低了68%.
圖 8 酶抑制劑對(duì)漆酶催化酸性黑ATT脫色的影響
3.9 助劑對(duì)脫色效果的影響
分別在脫色體系中加入0、0.1、0.5、1.0 μmol · L-1 濃度的ABTS，0、0.5、1、5、10 mmol · L-1濃度的HBT，探究脫色助劑對(duì)脫色率的影響.結(jié)果(圖 9、10)表明，在試驗(yàn)范圍內(nèi)ABTS對(duì)脫色影響不顯著;但HBT效果顯著，室溫下加入1 mmol · L-1 HBT反應(yīng)10 min，其脫色率可達(dá)到對(duì)照組(50 ℃)反應(yīng)60 min時(shí)的脫色率(87.35%)，顯著提高了漆酶的脫色效率.HBT是良好的氧化還原介質(zhì)，在漆酶催化染料脫色、紙漿漂白及其它污染物降解過(guò)程中起著重要作用的研究表明HBT是Pleurotus sajor-caju和G. lucidum所產(chǎn)漆酶脫色的最佳助劑.漆酶-HBT介質(zhì)系統(tǒng)對(duì)降 解Acid Red 1、Reactive Black 5、reactive red 239、reactive yellow 15、reactive blue 114等染料非常有效. HBT濃度為1.0 mmol · L-1時(shí)效果最佳(脫色率可達(dá)90.81%)，濃度大于1.0 mmol · L-1以后促進(jìn)作用反而降低(圖 10)，因?yàn)镠BT超過(guò)一定濃度時(shí)，其形成的自由基對(duì)漆酶的酶活有抑制作用.具體參見(jiàn)污水寶商城資料或http://www.dowater.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。
圖 9 ABTS對(duì)漆酶催化酸性黑ATT脫色的影響
圖 10 HBT對(duì)漆酶催化酸性黑ATT脫色的影響
4 結(jié)論
1)溫度、pH、加酶量、染料濃度這4個(gè)因素對(duì)漆酶催化復(fù)合染料酸性黑ATT脫色的效果有顯著影響.通過(guò)正交試驗(yàn)確定最優(yōu)脫色條件為酶活9 U · mL-1、pH 5.0、溫度為50 ℃、染料濃度為0.1 g · L-1，在此條件下的脫色率為87.35%.
2)實(shí)驗(yàn)證明G. lucidum wz-32粗酶液可以對(duì)偶氮染料進(jìn)行直接脫色，無(wú)需加入介質(zhì)，可能是未純化的粗酶液中有充當(dāng)介質(zhì)的未知小分子物質(zhì).
3)金屬離子Co2+、Fe2+、Mn2+、Ca2+、I-對(duì)G.lucidum wz-32漆酶脫色有抑制作用，Mn2+和I-尤其明顯;Na+、Mg2+、Cu2+對(duì)脫色有一定的促進(jìn)作用.酶抑制劑和脫色助劑的實(shí)驗(yàn)表明，EDTA-鈉對(duì)脫色的抑制作用不顯著，而SDS的抑制作用非常顯著;HBT對(duì)脫色的促進(jìn)作用顯著，是非常有效的脫色助劑.